Альцгеймер оорусу (АД) диагностиканын жана дарылоонун прогрессине тоскоол болуп, анын бир нече негизги патофизиологиясын чагылдырган белок биомаркерлери жок. Бул жерде биз AD патофизиологиясынын кеңири спектрин чагылдырган жүлүн суюктугунун (CSF) биомаркерлерин аныктоо үчүн комплекстүү протеомиканы колдонобуз. Multiplex массалык спектрометрия тиешелүүлүгүнө жараша AD CSF жана мээде болжол менен 3500 жана болжол менен 12000 белокторду аныктады. Мээнин протеомунун тармактык анализи биоартүрдүүлүктүн 44 модулун чечти, алардын 15и жүлүн суюктугунун протеому менен дал келет. Бул кабатталган модулдардагы CSF AD маркерлери ар кандай патофизиологиялык процесстерди чагылдырган беш белок тобуна бүктөлгөн. AD мээдеги синапстар жана метаболиттер азаят, бирок CSF көбөйөт, ал эми мээдеги жана CSFдагы глиалга бай миелинизация жана иммундук топтор көбөйөт. Панелдин өзгөрүшүнүн ырааттуулугу жана оорунун өзгөчөлүгү 500дөн ашык кошумча CSF үлгүлөрүндө тастыкталды. Бул топтор, ошондой эле асимптоматикалык AD биологиялык подгруппаларды аныкташкан. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар AD клиникалык колдонмолор үчүн веб-негизделген биомаркер куралдарына карай келечектүү кадам болуп саналат.
Альцгеймер оорусу (АД) дүйнө жүзү боюнча нейродегенеративдик деменциянын эң кеңири таралган себеби болуп саналат жана биологиялык системанын дисфункцияларынын кеңири спектри менен мүнөздөлөт, анын ичинде синаптикалык трансмиссия, глиалдык иммунитет жана митохондриялык метаболизм (1-3). Бирок, анын белгиленген белок биомаркерлери дагы эле амилоид жана тау протеиндерин аныктоого багытталган, ошондуктан бул ар түрдүү патофизиологияны чагылдыра албайт. Бул "негизги" протеин биомаркерлери мээ-жүлүн суюктугунда эң ишенимдүү өлчөнөт (i) амилоид бета пептид 1-42 (Aβ1-42), ал кортикалдык амилоиддик бляшкалардын пайда болушун чагылдырат; (ii) жалпы tau, аксон дегенерациянын белгиси; (iii) phospho-tau (p-tau), патологиялык тау гиперфосфорлануунун өкүлү (4-7). Бул жүлүн суюктугунун биомаркерлери "белгиленген" AD протеин ооруларын (4-7) аныктообузга чоң жардам бергенине карабастан, алар оорунун артында турган татаал биологиянын кичинекей бир бөлүгүн гана билдирет.
АД биомаркерлеринин патофизиологиялык ар түрдүүлүгүнүн жоктугу көптөгөн кыйынчылыктарга алып келди, анын ичинде (i) АД менен ооруган бейтаптардын биологиялык гетерогендүүлүгүн аныктоо жана сандык аныктоо мүмкүн эместиги, (ii) оорунун оордугун жана прогрессиясын жетишсиз өлчөө, өзгөчө клиникага чейинки стадияда жана ( iii) неврологиялык начарлоонун бардык аспектилерин толук чече албаган терапиялык препараттарды иштеп чыгуу. Кошумча оорулардан АД-ны сүрөттөө үчүн маанилүү патологияга таянганыбыз бул көйгөйлөрдү ого бетер курчутат. Көбүрөөк далилдер кем акылдыгы бар улгайган адамдардын көпчүлүгүндө когнитивдик начарлоонун бирден ашык патологиялык мүнөздөмөсү бар экенин көрсөтүп турат (8). AD патологиясы бар адамдардын 90% же андан көп бөлүгүндө кан тамыр оорулары, TDP-43 кошулмалары же башка дегенеративдик оорулар бар (9). Патологиялык кайталануунун бул жогорку пропорциялары биздин деменциянын диагностикалык негиздерин бузуп, оорунун кеңири патофизиологиялык аныктамасы талап кылынат.
Ар түрдүү AD биомаркерлерине болгон шашылыш муктаждыкты эске алуу менен, талаа биомаркерлерди ачуу үчүн жалпы системага негизделген "омикс" ыкмасын көбүрөөк колдонууда. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance 2014-жылы ишке киргизилген жана программанын башында турат. Улуттук Саламаттыкты сактоо Институтунун, академиянын жана өнөр жайдын бул мультидисциплинардык аракети АДдын патофизиологиясын жакшыраак аныктоо жана биоартүрдүүлүктүн диагностикалык талдоо жана дарылоо стратегияларын иштеп чыгуу үчүн системага негизделген стратегияларды колдонууга багытталган (10). Бул долбоордун алкагында, тармактык протеомика AD системасына негизделген биомаркерлерди өнүктүрүү үчүн келечектүү курал болуп калды. Бул калыс маалыматка негизделген ыкма комплекстүү протеомика маалыматтар топтомун топторго же белгилүү бир клетка түрлөрү, органеллдер жана биологиялык функциялар менен байланышкан биргелешкен протеиндердин "модулдарына" уюштурат (11-13). Дээрлик 12 маалыматка бай тармак протеомикасы изилдөөлөр AD мээ (13-23) боюнча жүргүзүлгөн. Жалпысынан алганда, бул анализдер AD мээ тармагы протеома көз карандысыз когорттордо жана бир нече кортикалдык аймактарда жогорку деңгээлде сакталган модулдук уюмду сактап турганын көрсөтүп турат. Мындан тышкары, бул модулдардын кээ бирлери бир нече оорулардын патофизиологиясын чагылдырган маалымат топтомдору боюнча AD-байланыштуу молчулуктун кайталануучу өзгөрүүлөрүн көрсөтөт. Жалпысынан алганда, бул табылгалар мээ тармагынын протеомунун ADдагы системага негизделген биомаркер катары ачылышы үчүн келечектүү таяныч пунктун көрсөтөт.
AD мээ тармагы протеомун клиникалык жактан пайдалуу системага негизделген биомаркерлерге айландыруу үчүн, биз мээден алынган тармакты AD CSF протеомикалык анализи менен бириктирдик. Бул комплекстүү мамиле мээге негизделген патофизиологиянын кеңири спектри, анын ичинде синапстарды, кан тамырларды, миелинизацияны, сезгенүүнү жана метаболизмдик жолдордун дисфункциясын камтыган CSF биомаркерлеринин беш келечектүү топтомун аныктоого алып келди. Биз ар кандай нейродегенеративдик оорулардан 500дөн ашык CSF үлгүлөрүн камтыган бир нече репликация анализдери аркылуу бул биомаркер панелдерин ийгиликтүү тастыктадык. Бул валидация анализдерине асимптоматикалык AD (AsymAD) менен ооруган бейтаптардын CSF тобунун максаттарын изилдөө же нормалдуу когнитивдик чөйрөдө анормалдуу амилоиддердин топтолушунун далилин көрсөтүү кирет. Бул анализдер AsymAD популяциясынын олуттуу биологиялык гетерогендүүлүгүн баса белгилейт жана оорунун эң алгачкы стадияларында индивиддерди субтиптештире ала турган панель маркерлерин аныктайт. Жалпысынан алганда, бул натыйжалар AD туш болгон көптөгөн клиникалык көйгөйлөрдү ийгиликтүү чече ала турган бир нече системага негизделген протеин биомаркер куралдарын өнүктүрүүдө негизги кадам болуп саналат.
Бул изилдөөнүн негизги максаты AD алып мээге негизделген патофизиологияны чагылдырган жаңы жүлүн суюктугунун биомаркерлерин аныктоо болуп саналат. Сүрөт S1 изилдөө методологиябызды камтыйт, ал (i) мээ менен байланышкан бир нече CSF оорусунун биомаркерлерин аныктоо үчүн AD CSF жана тармактык мээ протеомунун алдын ала жыйынтыктары менен шартталган комплекстүү анализди жана (ii) кийинки репликацияны камтыйт. суюктуктар. Ачылышка багытталган изилдөө Эмори Гойзуета Альцгеймер оорусун изилдөө борборунда (ADRC) 20 когнитивдик нормалдуу адамдарда жана 20 AD пациентинде CSF дифференциалдык экспрессиясын талдоо менен башталды. AD диагностикасы төмөнкү Aβ1-42 жана мээ-жүлүн суюктугундагы жалпы tau жана p-tau деңгээлинин жогорулашында олуттуу когнитивдик бузулуу катары аныкталат [Орточо Монреал Когнитивдик Баалоо (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (таблица S1A). контролдоо (MoCA дегенди билдирет, 26.7 ± 2.2) CSF биомаркерлердин нормалдуу денгээлде болгон.
Адамдын CSF протеиндин көптүгүнүн динамикалык диапазону менен мүнөздөлөт, анда альбумин жана башка өтө көп протеиндер кызыккан белокторду аныктоого тоскоол болот (24). Белоктун ачылышынын тереңдигин жогорулатуу үчүн, биз масс-спектрометрия (MS) анализине чейин ар бир CSF үлгүсүнөн биринчи 14 абдан көп протеинди алып салдык (24). MS тарабынан жалпысынан 39,805 пептиддер аныкталган, алар 40 үлгүдөгү 3691 протеомдун картасына түшүрүлгөн. Протеиндин санын аныктоо бир нече тандемдик масса теги (TMT) маркировкалоосу менен жүргүзүлөт (18, 25). Жетишпеген маалыматтарды чечүү үчүн, биз кийинки талдоодо үлгүлөрдүн кеминде 50% санында аныкталган протеиндерди гана киргиздик, акыры 2875 протеоманын санын аныктадык. Жалпы протеиндин көптүгүнүн деңгээлиндеги олуттуу айырмачылыктан улам, контролдук үлгү статистикалык жактан чектен чыккан (13) деп эсептелип, кийинки анализге киргизилген эмес. Калган 39 үлгүлөрдүн молчулук маанилери жашына, жынысына жана партия ковариациясына (13-15, 17, 18, 20, 26) жараша туураланган.
Регрессиялык маалымат топтомундагы дифференциалдык туюнтманы баалоо үчүн статистикалык t-тест анализин колдонуу менен, бул талдоо контролдук жана AD учурларынын (таблица S2A) ортосунда көптүк деңгээли олуттуу өзгөргөн (P <0,05) белокторду аныктады. 1А-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, АД-да жалпысынан 225 белоктун көптүгү бир топ кыскарган, ал эми 303 белоктун көптүгү бир топ жогорулаган. Бул дифференциалдуу түрдө көрсөтүлгөн протеиндер бир нече мурда аныкталган жүлүн суюктугунун AD маркерлерин камтыйт, мисалы, микротүтүкчөлөр менен байланышкан протеин tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), нейрофиламент (NEFL; P = 6.56 × 10−3), өсүү менен байланышкан протеин 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Май кислотасын бириктирүүчү протеин 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Хитиназа 3 сыяктуу 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Нейрондук Гранулин (NRGN; P = 3.43 × 10−4) жана VGF нерв өсүү фактору (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Бирок, биз ошондой эле, мисалы, ИДПнын диссоциациясынын ингибитору 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) жана SPARC менен байланышкан модулдук кальций байланышы 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) сыяктуу башка абдан маанилүү максаттарды аныктадык. Gene Ontology (GO) 225 кыйла кыскарган белокторду талдоо стероиддик метаболизм, кандын уюшу жана гормондордун активдүүлүгү сыяктуу дене суюктугу процесстери менен тыгыз байланышты аныктады (Figure 1B жана Table S2B). Ал эми, 303 бир кыйла көбөйгөн белок клетка түзүлүшү жана энергия алмашуу менен тыгыз байланышта.
(A) Жанар тоонун графиги t-тест менен алынган -log10 статистикалык P маанисине (y огу) салыштырмалуу log2 бүктөм өзгөрүшүн (х огу) көрсөтөт, ал башкаруу (CT) менен Бардык белоктордун CSF протеомунун AD учурлары. AD олуттуу кыскарган денгээлде протеиндер (P <0,05) көк, ал эми оору бир кыйла жогорулаган белоктор кызыл менен көрсөтүлгөн. Тандалган белок белгиленет. (B) белок менен байланышкан жогорку GO терминдер AD олуттуу кыскарган (көк) жана көбөйгөн (кызыл). Биологиялык процесстер, молекулярдык функциялар жана клеткалык компоненттер тармактарында эң жогорку z-упайлары бар үч GO терминин көрсөтөт. (C) MS CSF үлгүсүндөгү MAPT деңгээлин өлчөгөн (солдо) жана анын ELISA tau үлгүсүнүн деңгээли (оң) менен байланышы. Тиешелүү P мааниси менен Пирсон корреляция коэффициенти көрсөтүлөт. Бир AD иши үчүн ELISA маалыматтарынын жоктугунан улам, бул сандар талданган 39 иштин 38и үчүн маанилерди камтыйт. (D) көзөмөлгө кластердик талдоо (P <0.0001, Бенжамин-Хочберг (BH) жөнгө P <0.01) контролдоо жана AD CSF маалыматтар топтомун 65 абдан олуттуу өзгөргөн белокторду колдонуп үлгүлөрдү табылган. Стандартташтыруу, нормалдаштыруу.
MAPT протеомикалык деңгээл көз карандысыз өлчөнгөн ELISA tau деңгээл менен тыгыз байланышта (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figure 1C), биздин MS өлчөө негиздүүлүгүн колдоо. Амилоиддик прекурсор протеининин (APP) деңгээлинде трипсин сиңирилгенден кийин, Aβ1-40 жана Aβ1-42нин C-терминусуна түшүрүлгөн изоформ-спецификалык пептиддер эффективдүү иондошкон эмес (27, 28). Ошондуктан, биз аныктаган APP пептиддери ELISA Aβ1-42 деңгээли менен эч кандай байланышы жок. Ар бир иштин дифференциалдык экспрессиясын баалоо үчүн биз үлгүлөрдүн көзөмөлдөнгөн кластердик анализин жүргүзүү үчүн P <0,0001 [жалган ачылыш ылдамдыгы (FDR) оңдолгон P <0,01] менен дифференциалдуу түрдө көрсөтүлгөн протеиндерди колдондук (таблица S2A). 1D-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, бул 65 өтө маанилүү белок контролго окшош мүнөздөмөлөргө ээ болгон бир AD учурун кошпогондо, оорунун абалына жараша үлгүлөрдү туура топтой алат. Бул 65 белоктордун ичинен 63 AD көбөйдү, ал эми экөө гана (CD74 жана ISLR) азайган. Жалпысынан, бул жүлүн суюктугунун анализдери оорунун биомаркерлери катары кызмат кыла турган ADдагы жүздөгөн протеиндерди аныктады.
Андан кийин биз AD мээ протеомунун көз карандысыз тармак талдоо жүргүздүк. Бул ачылыштын мээ когорту dorsolateral prefrontal кортексти (DLPFC) контролдоодон (n = 10), Паркинсон оорусу (PD; n = 10), аралаш AD / PD (n = 10) жана AD (n = 10) учурларды камтыды. ) Үлгү. Эмери Гоизуэта ADRC. Бул 40 иштин демографиясы мурда сүрөттөлгөн (25) жана S1B таблицасында жалпыланган. Биз TMT-MSти бул 40 мээ кыртышын жана 27 учурдун репликация когортун талдоо үчүн колдондук. Жалпысынан бул эки мээ маалымат топтому 227 121 уникалдуу пептиддерди өндүргөн, алар 12 943 протеомага (25) картага түшүрүлгөн. Кийинки изилдөөлөргө 50%дан кем эмес сандагы протеиндер гана киргизилген. Акыркы ачылыш маалыматтар топтому 8817 сандык белокторду камтыйт. Жашына, жынысына жана өлгөндөн кийинки интервалга (PMI) жараша белоктун көптүгүн тууралаңыз. регрессия кийин маалыматтарды топтомун дифференциалдык туюнтма талдоо> 2000 протеин деңгээли эки же андан көп оору когорттарында олуттуу [P <0.05, дисперсияны талдоо (ANOVA)] өзгөргөнүн көрсөттү. Андан кийин, биз дифференциалдуу түрдө көрсөтүлгөн протеиндердин негизинде көзөмөлдөнгөн кластердик анализди жүргүздүк жана P <0,0001 AD/контролдук жана/же AD/PD салыштырууларында (Figure S2, A жана B, S2C таблицасы). Бул 165 өтө өзгөргөн протеиндер контролдонуучу жана PD үлгүлөрүндөгү AD патологиясы бар учурларды так сүрөттөп, бүт протеомдогу AD-спецификалык өзгөрүүлөрдү тастыктайт.
Андан кийин биз Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) деп аталган алгоритмди колдонуп, табылган мээ протеомунда тармактык анализди жүргүздүк, ал маалыматтар топтомун окшош экспрессия үлгүлөрү менен белок модулдарына уюштурат (11-13). Талдоо 44 модулду (M) биргелешип экспрессияланган белокторду аныктады, ириден (M1, n = 1821 белоктор) эң кичинесине чейин (M44, n = 34 белоктор) сорттолгон жана номерленген (Figure 2A жана Table S2D) ). Жогоруда айтылгандай (13) Ар бир модулдун репрезентативдик экспрессия профилин же мүнөздүү протеинди эсептеп, аны оорунун абалы жана AD патологиясы менен корреляциялаңыз, башкача айтканда, Альцгеймер оорусунун реестри (CERAD) жана Брак упайынын альянсын түзүңүз (сүрөт 2B). Жалпысынан алганда, 17 модулдар олуттуу AD neuropathology (P <0.05) менен байланышкан. Бул ооруга байланыштуу модулдардын көбү клетканын түрүнө тиешелүү маркерлерге бай (Figure 2B). Жогоруда айтылгандай (13), клетканын түрүн байытуу модулдун дал келишин жана клетканын типине тиешелүү гендердин маалымдама тизмесин талдоо жолу менен аныкталат. Бул гендер обочолонгон чычкан нейрондорунун, эндотелийдик жана глиалдык клеткалардагы жарыяланган маалыматтардан алынган. РНК секвенирлөө (РНК-сек) эксперименти (29).
(A) Мээнин протеомунун WGCNAсын табыңыз. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) модулдук кол протеин талдоо (модулдук белок сөз биринчи негизги компоненти) AD neuropathological мүнөздөмөлөрү менен (жогорку), анын ичинде CERAD (Aβ тактасы) жана Braak (tau чатак) упайлары. Оң (кызыл) жана терс (көк) корреляциянын интенсивдүүлүгү эки түстүү жылуулук картасы менен көрсөтүлөт, ал эми жылдызчалар статистикалык маанини көрсөтөт (P <0,05). Ар бир белок модулунун клетка түрүнүн ассоциациясын баалоо үчүн Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (төмөндө) колдонуңуз. Кызыл көлөкөлөрдүн интенсивдүүлүгү клетканын түрүн байытуу даражасын, ал эми жылдызча статистикалык маанини көрсөтөт (P <0,05). FETден алынган P маанисин оңдоо үчүн BH ыкмасын колдонуңуз. (C) модулдук протеиндердин GO анализи. Ар бир модул же тиешелүү модулдук топ үчүн эң тыгыз байланышкан биологиялык процесстер көрсөтүлгөн. олиго, олигодендроцит.
Беш жакын astrocyte жана microglia-бай модулдардын жыйындысы (M30, M29, M18, M24 жана M5) AD neuropathology менен күчтүү оң байланышты көрсөттү (Figure 2B). Онтологиялык анализ бул глиалдык модулдарды клетканын өсүшү, көбөйүшү жана иммунитети менен байланыштырат (Figure 2C жана Table S2E). Эки кошумча глиалдык модулдар, M8 жана M22, ошондой эле ооруда катуу жөнгө салынат. M8 тубаса иммундук жооп (30) негизги ролду ойнойт сигнал каскады, Toll сыяктуу кабылдагыч жолу менен абдан байланыштуу. Ошол эле учурда, M22 пост-котормо өзгөртүү менен тыгыз байланышта. Олигодендроциттерге бай M2 AD патологиясы менен күчтүү оң корреляцияны жана нуклеозиддердин синтези жана ДНКнын репликациясы менен онтологиялык байланышты көрсөтөт, бул ооруларда клеткалардын көбөйүшүн көрсөтөт. Жалпысынан алганда, бул табылгалар биз мурда AD тармагынын протеомунда байкаган глиалдык модулдардын көтөрүлүшүн колдойт (13, 17). Учурда тармактагы AD менен байланышкан көптөгөн глиалдык модулдар контролдоо жана PD учурларда төмөнкү экспрессия деңгээлин көрсөтүп, алардын ADда жогорулаган оорунун өзгөчөлүгүн баса белгилей турганы аныкталган (Figure S2C).
Биздин тармак протеомунун төрт модулу гана (M1, M3, M10 жана M32) AD патологиясы менен катуу терс байланышта (P <0.05) (Figure 2, B жана C). M1 жана M3 экөө тең нейрондук маркерлерге бай. M1 синаптикалык сигналдар менен тыгыз байланышта, ал эми M3 митохондриялык функция менен тыгыз байланышта. M10 жана M32 үчүн клетка түрүн байытуунун эч кандай далили жок. M32 M3 менен клетканын метаболизминин ортосундагы байланышты чагылдырат, ал эми M10 клетканын өсүшүнө жана микротүтүкчөлөрдүн иштешине абдан байланыштуу. AD менен салыштырганда, бардык төрт модулдар контролдоо жана PD көбөйүп, аларга оору-спецификалык AD өзгөрүүлөрдү берет (Figure S2C). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар биз мурда AD (13, 17) байкаган нейронго бай модулдардын азайган көптүгүн колдойт. Кыскача айтканда, биз ачкан мээ протеомунун тармактык анализи биздин мурунку табылгаларыбызга шайкеш келген AD үчүн өзгөртүлгөн модулдарды чыгарды.
AD клиникалык когнитивдик төмөндөшү жок амилоиддердин топтолушун көрсөткөн алгачкы асимптоматикалык стадия (AsymAD) менен мүнөздөлөт (5, 31). Бул асимптоматикалык этап эрте аныктоо жана кийлигишүү үчүн маанилүү терезе болуп саналат. Биз мурда көз карандысыз маалымат топтомдорунда AsymAD жана AD мээ тармагы протеомунун күчтүү модулдук сакталышын көрсөткөн (13, 17). Учурда биз ачкан мээ тармагы ушул мурунку табылгаларга шайкеш келишин камсыз кылуу үчүн, биз 27 DLPFC уюмдарынын репликацияланган маалымат топтомундагы 44 модулдун сакталышын талдадык. Бул уюмдарга контролдук (n = 10), AsymAD (n = 8) жана AD (n = 9) учурлары кирет. Control жана AD үлгүлөрү биздин ачылыш мээ когортунун анализине киргизилген (таблица S1B), ал эми AsymAD учурлары репликация когортунда гана уникалдуу болгон. Бул AsymAD учурлары Emory Goizueta ADRC мээ банкынан да келген. Өлүм учурунда таанып-билүү нормалдуу болгону менен, амилоиддердин деңгээли аномалдуу түрдө жогору болгон (орточо CERAD, 2,8 ± 0,5) (таблица S1B).
Бул 27 мээ кыртыштарынын TMT-MS талдоо 11,244 протеомалардын санын аныктоого алып келди. Бул акыркы санга үлгүлөрдүн кеминде 50% санында аныкталган белоктор гана кирет. Бул репликацияланган маалымат топтому биздин ачылыш мээ анализибизде аныкталган 8817 протеиндин 8638ин (98,0%) камтыйт жана контролдук жана AD когорттарынын ортосунда дээрлик 3000 олуттуу өзгөргөн протеинге ээ (P <0,05, дисперсияны талдоо үчүн Тукейдин жупташкан t тестинен кийин) ( Таблица S2F). Бул дифференциалдуу түрдө көрсөтүлгөн протеиндердин арасында 910 да AD жана мээ протеомунун контролдук учурларынын ортосунда олуттуу деңгээлдеги өзгөрүүлөрдү көрсөттү (P <0.05, ANOVA Tukey жупташкан т-тесттен кийин). Белгилей кетсек, бул 910 маркерлер протеомалардын ортосундагы өзгөрүү багытында өтө шайкеш келет (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figure S3A). Көбөйгөн протеиндердин арасында маалымат топтомдорунун ортосунда эң ырааттуу өзгөрүүлөр болгон белоктор негизинен глиалга бай M5 жана M18 модулдарынын мүчөлөрү (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 жана GFAP). Кыскартылган белоктордун ичинен эң ырааттуу өзгөрүүлөргө ээ болгондор дээрлик синапс менен байланышкан M1 модулунун (NPTX2, VGF жана RPH3A) мүчөлөрү болгон. Биз андан ары ортоңку бездин (MDK), CD44, секрецияланган бырыштуу протеиндин 1 (SFRP1) жана VGF менен AD-байланыштуу өзгөрүүлөрүн батыш blotting аркылуу текшердик (Figure S3B). Модулдун сакталышын талдоо мээ протеомундагы протеиндик модулдардын 80% га жакыны (34/44) репликация маалымат топтомунда олуттуу сакталганын көрсөттү (z-балл> 1,96, FDR оңдолгон P <0,05) (Figure S3C). Бул модулдардын он төртү атайын эки протеомдун ортосунда сакталган (z-score> 10, FDR түзөтүлгөн P <1.0 × 10−23). Жалпысынан, мээ протеомунун ортосундагы дифференциалдык экспрессиянын жана модулдук курамынын жогорку даражадагы ырааттуулуктун ачылышы жана репликациясы AD фронталдык кортекс белокторундагы өзгөрүүлөрдүн кайталанышын баса белгилейт. Мындан тышкары, ал ошондой эле AsymAD жана өнүккөн оорулар абдан окшош мээ тармагы түзүлүшкө ээ экенин тастыктады.
Мээнин репликациясынын маалымат топтомундагы дифференциалдык экспрессиянын кеңири анализи AsymAD протеининин өзгөрүшүнүн олуттуу даражасын, анын ичинде AsymAD менен контролдун ортосундагы 151 олуттуу өзгөргөн белокторду баса көрсөтөт (P <0,05) (Figure S3D). Амилоиддик жүктөмгө ылайык, AsymAD жана AD мээсинде APP бир кыйла өстү. MAPT ADда гана олуттуу өзгөрөт, бул чыр-чатактардын жогорулашына жана анын таанып-билүүнүн төмөндөшү менен белгилүү болгон корреляциясына шайкеш келет (5, 7). Глиалга бай модулдар (M5 жана M18) AsymADдагы протеиндердин көбөйүшүнө өтө чагылдырылган, ал эми нейронго байланыштуу M1 модулу AsymADдагы азайган белоктордун эң өкүлү болуп саналат. Бул AsymAD маркерлеринин көбү симптоматикалык ооруларда көбүрөөк өзгөрүүлөрдү көрсөтөт. Бул маркерлердин арасында SMOC1, M18ге таандык глиалдык протеин бар, ал мээнин шишиги жана көздүн жана буттун өнүгүшүнө байланыштуу (32). MDK клетканын өсүшүнө жана ангиогенезге (33) байланыштуу гепаринди байланыштырган өсүү фактору, M18дин дагы бир мүчөсү. Көзөмөл тобу менен салыштырганда, AsymAD бир кыйла өскөн, андан кийин AD көбүрөөк өскөн. Ал эми, синаптикалык протеин neuropentraxin 2 (NPTX2) AsymAD мээсинде олуттуу кыскарган. NPTX2 мурда нейродегенерация менен байланышкан жана дүүлүктүрүүчү синапстарды арачылык кылууда таанылган ролго ээ (34). Жалпысынан алганда, бул натыйжалар оорунун оордугуна жараша прогрессивдүү көрүнгөн ADдагы ар кандай клиникага чейинки протеиндик өзгөрүүлөрдү көрсөтөт.
Мээнин протеомунун ачылышында биз протеиндик камтуунун олуттуу тереңдигине жеткенибизди эске алып, анын тармак деңгээлиндеги AD транскриптому менен дал келүүсүн толугураак түшүнүүгө аракет кылып жатабыз. Ошондуктан, биз ачкан мээ протеомун AD (n = 308) жана контролдоо (n = 157) DLPFC ткандарында (13) 18,204 гендин микроаррей өлчөөсүнөн мурда түзүлгөн модул менен салыштырдык. кайталануу. Бардыгы болуп, биз 20 түрдүү РНК модулдарын аныктадык, алардын көбү нейрондор, олигодендроцит, астроцит жана микроглия сыяктуу клеткалардын белгилүү түрлөрүн байытууну көрсөткөн (Figure 3A). AD бул модулдардын бир нече өзгөрүүлөр 3B сүрөттө көрсөтүлгөн. Биздин мурунку протеин-РНКнын кайталануу анализине ылайык, тереңирээк белгиленбеген MS протеомунун (болжол менен 3000 протеин) (13), биз тапкан мээ протеом тармагындагы 44 модулдун көбү транскриптомдук тармакта. мээ протеомунда абдан сакталган 34 белок модулунун ачылышы жана репликациясы Фишердин так сынагынан (FET) 14ү гана (~40%) өттү, транскриптом менен статистикалык жактан маанилүү дал келээрин далилдеди (Figure 3A). ДНКнын бузулушун оңдоого (P-M25 жана P-M19), протеинди которууга (P-M7 жана P-M20), РНКны байланыштыруу/кошумчалоо (P-M16 жана P-M21) жана протеинди максаттуу (P-M13 жана P-) менен шайкеш келет. M23) транскриптомдогу модулдар менен дал келбейт. Ошондуктан, протеомдун тереңирээк маалымат топтому учурдагы кайталанган анализде (13) пайдаланылганына карабастан, AD тармагынын протеомунун көпчүлүгү транскриптомдук тармакка түшүрүлгөн эмес.
(A) Гипергеометриялык FET AD транскриптомунун (жогорку) РНК модулундагы клетканын типине мүнөздүү маркерлердин байышын жана AD мээсинин РНК (x огу) жана протеин (y огу) модулдарынын ортосундагы дал келүү даражасын көрсөтөт. (төмөндө). Кызыл көлөкөлөрдүн интенсивдүүлүгү үстүнкү панелдеги клетка түрлөрүнүн байылуу даражасын жана ылдыйкы панелдеги модулдардын кабатталышынын интенсивдүүлүгүн көрсөтөт. Жылдызчалар статистикалык маанини көрсөтөт (P <0,05). (B) Ар бир транскриптомдук модулдун мүнөздүү гендеринин жана AD статусунун ортосундагы корреляциянын даражасы. Сол жактагы модулдар AD (көк) менен эң терс корреляцияланган, ал эми оң жактагылар AD (кызыл) менен эң оң корреляцияланган. Лог-трансформацияланган BH-түзөтүлгөн P мааниси ар бир корреляциянын статистикалык маанисинин даражасын көрсөтөт. (C) Бөлүштүрүлгөн клетканын түрүн байытуу менен олуттуу кабатталган модулдар. (D) Кайталануучу модулда белгиленген протеиндин (x огу) жана РНКнын (y огу) log2 эсе өзгөрүшүнүн корреляциялык анализи. Тиешелүү P мааниси менен Пирсон корреляция коэффициенти көрсөтүлөт. Микро, микроглия; асман телолору, астроциттер. КТ, контролдоо.
Көпчүлүк кабатталган белок жана РНК модулдары окшош клетка түрүн байытуу профилдерин жана ырааттуу AD өзгөртүү багыттарын бөлүшөт (сүрөт 3, В жана С). Башка сөз менен айтканда, мээнин протеомунун (PM1) синапс менен байланышкан M1 модулу үч нейронго бай гомологдук РНК модулдарына (R-M1, R-M9 жана R-M16) картага түшүрүлгөн, алар ADда жайгашкан. төмөндөтүлгөн деңгээл. Ошо сыяктуу эле, глиалга бай M5 жана M18 белок модулдары астроциттерге жана микроглиалдык маркерлерге (R-M3, R-M7 жана R-M10) бай РНК модулдары менен дал келет жана оорулардын көбөйүшүнө катуу катышат. Бул эки маалымат топтомунун ортосундагы бөлүшүлгөн модулдук өзгөчөлүктөр андан ары клетканын түрүн байытууну жана биз мээ протеомунда байкаган ооруга байланыштуу өзгөрүүлөрдү колдойт. Бирок, биз бул бөлүшүлгөн модулдарда жеке маркерлердин РНК жана белок деңгээлдеринин ортосунда көптөгөн олуттуу айырмачылыктарды байкадык. Бул бири-бирин кайталаган модулдардын ичиндеги молекулалардын протеомикасынын жана транскриптомикасынын дифференциалдык экспрессиясынын корреляциялык анализи (3D-сүрөт) бул дал келбестигин баса белгилейт. Мисалы, APP жана башка бир нече глиалдык модулдун белоктору (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 жана SFRP1) AD протеомунун олуттуу өсүшүн көрсөттү, бирок AD транскриптомунда дээрлик эч кандай өзгөрүү болгон жок. Бул протеинге мүнөздүү өзгөрүүлөр амилоиддик бляшкалар менен тыгыз байланышта болушу мүмкүн (23, 35), патологиялык өзгөрүүлөрдүн булагы катары протеомду баса белгилейт жана бул өзгөрүүлөр транскриптомдо чагылдырылбашы мүмкүн.
Биз тапкан мээни жана CSF протеомдорун өз алдынча талдап чыккандан кийин, биз мээ тармагынын патофизиологиясына байланыштуу AD CSF биомаркерлерин аныктоо үчүн эки маалымат топтомун ар тараптуу талдоо жүргүздүк. Биз адегенде эки протеоманын дал келишин аныкташыбыз керек. CSF AD мээсинде нейрохимиялык өзгөрүүлөрдү чагылдырат деп кеңири кабыл алынганы менен (4), AD мээси менен CSF протеомунун ортосунда дал келген так даражасы түшүнүксүз. Биздин эки протеомдордо аныкталган жалпы ген продуктыларынын санын салыштыруу менен, биз мээ жүлүн суюктугунда аныкталган белоктордун дээрлик 70% (n = 1936) да мээде (Figure 4A) өлчөнгөнүн таптык. Бул кабатталган протеиндердин көпчүлүгү (n = 1721) ачылыш мээнин маалымат топтомунан 44 биргелешкен экспрессия модулдарынын бирине окшоштурулган (Figure 4B). Күтүлгөндөй, алты эң чоң мээ модулдары (M1ден M6га чейин) CSF дал келүүсүнүн эң көп көлөмүн көрсөттү. Бирок, кичинекей мээ модулдары (мисалы, M15 жана M29) бар, алар күтүлбөгөн жерден бири-бирине дал келбеген жогорку даражага жетишет, мээ модулунан эки эсе чоңураак. Бул мээ менен жүлүн суюктугунун ортосундагы дал келүүнү эсептөө үчүн дагы деталдаштырылган, статистикалык жактан негизделген ыкманы колдонууга түрткү берет.
(А жана В) Ачылган мээде жана CSF маалымат топтомдорунда аныкталган белоктор бири-бирине дал келет. Бул кабатталган протеиндердин көбү мээнин ко-экспрессия тармагынын 44 ко-экспрессия модулунун бири менен байланышкан. (C) Жүлүн суюктугунун протеому менен мээ тармагы протеомунун ортосундагы дал келүүнү табыңыз. Жылуулук картасынын ар бир сабы гипергеометриялык FETтин өзүнчө кайталанган анализин билдирет. Жогорку сап мээнин модулу менен бүт CSF протеомунун ортосундагы кайталанууну (боз/кара көлөкө) сүрөттөйт. Экинчи сызык мээнин модулдары менен CSF протеининин (кызыл түскө боёлгон) ортосундагы дал келүү AD (P <0,05) кыйла жогору жөнгө салынганын сүрөттөйт. Үчүнчү сап мээ модулдары менен CSF протеининин (көк көлөкө) ортосундагы дал келүү AD (P <0.05) кыйла ылдый жөнгө экенин көрсөтүп турат. FETден алынган P маанисин оңдоо үчүн BH ыкмасын колдонуңуз. (D) уяча түрү бирикмесине жана тиешелүү GO шарттарына негизделген бүктөлүүчү модуль панели. Бул панелдер CSF протеомунда маанилүү дифференциалдык экспрессияга ээ болгон жалпысынан мээге байланыштуу 271 протеинди камтыйт.
Бир куйруктуу FETs колдонуп, биз CSF протеомунун жана жеке мээ модулдарынын ортосундагы протеиндин кайталанышынын маанилүүлүгүн бааладык. Талдоо көрсөткөндөй, CSF маалымат топтомундагы жалпысынан 14 мээ модулунун статистикалык жактан маанилүү дал келүүлөрү (FDR жөндөлгөн P <0,05) жана кошумча модулдун (M18) дал келиши мааниге жакын (FDR туураланган P = 0,06) (Figure 4C) , жогорку сап). Бизди дифференциалдуу түрдө CSF белоктору менен катуу дал келген модулдар да кызыктырат. Ошондуктан, биз (i) CSF протеин AD олуттуу көбөйгөн жана (ii) CSF белок AD олуттуу кыскарган аныктоо үчүн эки кошумча FET талдоо колдонулат (P <0.05, жупташкан т сыноо AD / башкаруу) Маанилүү бири-бирине дал келген мээ модулдары алардын ортосунда. 4C-сүрөттүн ортоңку жана төмөнкү катарларында көрсөтүлгөндөй, бул кошумча анализдер 44 мээ модулунун 8и AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 жана M38) кошулган белок менен олуттуу түрдө дал келерин көрсөтүп турат. . ), ал эми эки гана модулдар (M6 жана M15) AD CSF кыскарган белок менен маанилїї дал келгенин көрсөттү. Күтүлгөндөй, бардык 10 модулдар CSF протеому менен эң жогорку дал келген 15 модулдун ичинде. Ошондуктан, биз бул 15 модулдар AD мээден алынган CSF биомаркерлердин жогорку кирешелүү булактары болуп саналат деп ойлойбуз.
Биз бул 15 кабатталган модулдарды WGCNA дарак диаграммасында алардын жакындыгына жана алардын клетка типтери жана ген онтологиясы менен байланышына негизделген беш чоң протеин панелине бүктөгөнбүз (4D-сүрөт). Биринчи панелде нейрон маркерлерине жана синапс менен байланышкан протеиндерге бай модулдар бар (M1 жана M12). Синаптикалык панелде жалпысынан 94 протеин бар жана CSF протеомундагы деңгээлдер олуттуу түрдө өзгөрүп, ал беш панелдин арасында мээге байланыштуу CSF маркерлеринин эң чоң булагы болуп калды. Экинчи топ (M6 жана M15) эндотелийдик клетка маркерлери жана кан тамыр денеси менен тыгыз байланышты көрсөттү, мисалы, "жараттарды айыктыруу" (M6) жана "гуморалдык иммундук жоопту жөнгө салуу" (M15). M15 ошондой эле эндотелий менен тыгыз байланышта болгон липопротеиндердин метаболизмине абдан байланыштуу (36). Кан тамыр панелинде мээге тиешелүү 34 CSF маркерлери бар. Үчүнчү топко олигодендроцит маркерлерине жана клетканын көбөйүшүнө олуттуу байланыштуу болгон модулдар (M2 жана M4) кирет. Мисалы, M2 жогорку деңгээлдеги онтология терминдерине "ДНКнын репликациясынын оң жөнгө салынышы" жана "пурин биосинтезинин процесси" кирет. Ошол эле учурда, M4 бул "глиалдык клетка дифференциациясын" жана "хромосомалардын бөлүнүшүн" камтыйт. myelination панели мээге байланыштуу 49 CSF маркерлерди камтыйт.
Төртүнчү топ эң көп модулдарды камтыйт (M30, M29, M18, M24 жана M5), жана дээрлик бардык модулдар микроглия жана астроцит маркерлерине кыйла бай. Миелиндөө панелине окшош, төртүнчү панелде да клетканын көбөйүшү менен тыгыз байланышта болгон модулдар (M30, M29 жана M18) бар. Бул топтун башка модулдары “иммундук эффект процесси” (M5) жана “иммундук жоопту жөнгө салуу” (M24) сыяктуу иммунологиялык терминдер менен абдан байланыштуу. Глиалдык иммундук топ мээге тиешелүү 42 CSF маркерлерин камтыйт. Акыр-аягы, акыркы панелде төрт модулда (M44, M3, M33 жана M38) мээге байланыштуу 52 маркер камтылган, алардын баары денеде энергияны сактоо жана метаболизм менен байланышкан. Бул модулдардын эң чоңу (M3) митохондрия менен тыгыз байланышта жана нейронго тиешелүү маркерлерге бай. M38 бул метаболомдун кичинекей модулунун мүчөлөрүнүн бири жана ошондой эле орточо нейрон өзгөчөлүгүн көрсөтөт.
Жалпысынан алганда, бул беш панелдер AD кортексиндеги клетка түрлөрүнүн жана функцияларынын кеңири спектрин чагылдырат жана жалпысынан мээге байланыштуу 271 CSF маркерлерин камтыйт (таблица S2G). Бул MS натыйжаларынын аныктыгын баалоо үчүн, биз мультиплекстөө жөндөмдүүлүгү, жогорку сезгичтиги жана спецификасы бар ортогоналдык антителолорго негизделген технологияны (ПЭА) колдондук жана мээ жүлүн суюктугунун үлгүлөрүн кайра анализдедик, биз бул 271 биомаркердин бир бөлүгүн таптык. (n = 36). Бул 36 максат биздин MS негизиндеги табылгаларыбыз менен тыгыз байланышта болгон PEA бир нече AD өзгөрүшүн көрсөтүп турат (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), бул биздин комплекстүү MS анализибиздин натыйжаларын катуу тастыктады (Figure S4) ).
Биздин беш топ баса белгилеген биологиялык темалар, синаптикалык сигнализациядан баштап энергетикалык метаболизмге чейин, бардыгы AD патогенезине байланыштуу (1-3). Демек, бул панелдерди камтыган бардык 15 модулдар биз ачкан мээ протеомундагы AD патологиясына байланыштуу (Figure 2B). Эң көрүнүктүү биздин глиалдык модулдардын ортосундагы жогорку оң патологиялык корреляция жана эң чоң нейрондук модулдарыбыздын (M1 жана M3) ортосундагы күчтүү терс патологиялык корреляция. Биздин репликацияланган мээ протеомунун дифференциалдык экспрессия анализи (Figure S3D) ошондой эле M5 жана M18ден алынган глиалдык протеиндерди баса белгилейт. AsymAD жана симптоматикалык АДда глиалдык белоктор жана M1-байланыштуу синапстар эң көбөйөт. Белок эң азаят. Бул байкоолор беш топко кирген 271 жүлүн суюктугунун маркерлери AD кортексиндеги оору процесстерине, анын ичинде алгачкы симптомсуз этаптарда пайда болгондорго байланыштуу экенин көрсөтүп турат.
Мээдеги жана жүлүн суюктугундагы панелдик протеиндердин өзгөрүү багытын жакшыраак талдоо үчүн биз бири-бирин кайталаган 15 модулдун ар бири үчүн төмөндөгүлөрдү тарттык: (i) мээнин маалымат топтомундагы модулдун көптүгүнүн деңгээлин жана (ii) модулдун белок Айырма жүлүн суюктугунда (сүрөт S5) көрсөтүлөт. Жогоруда айтылгандай, WGCNA модулдун көптүгүн же мээдеги протеиндин мүнөздүү маанисин аныктоо үчүн колдонулат (13). Вулкан картасы жүлүн суюктугундагы модулдук протеиндердин дифференциалдык экспрессиясын сүрөттөө үчүн колдонулат (AD/control). Бул көрсөткүчтөр беш панелдин үчөө мээ жана жүлүн суюктугунун ар кандай экспрессия тенденцияларын көрсөткөнүн көрсөтүп турат. Синапс панелинин эки модулу (M1 жана M12) AD мээсинде молдук деңгээлинин төмөндөшүн көрсөтөт, бирок AD CSFдеги протеиндин көбөйүшү менен олуттуу дал келет (Figure S5A). Метаболомду камтыган нейронго байланыштуу модулдар (M3 жана M38) окшош мээ жана жүлүн суюктугунун экспрессия үлгүлөрүн дал келбегендигин көрсөттү (Figure S5E). Анын модулдары (M6 жана M15) AD мээсинде орточо жогорулаган жана оорулуу CSF (Figure S5B) азайган болсо да, тамыр панели, ошондой эле ар кандай экспрессия тенденцияларын көрсөттү. Калган эки панелдерде чоң глиалдык тармактар бар, алардын белоктору эки бөлүмдө тең ырааттуу түрдө жогору жөнгө салынат (Figure S5, C жана D).
Бул тенденциялар бул панелдердеги бардык маркерлер үчүн жалпы эмес экенин эске алыңыз. Мисалы, синаптикалык панелде AD мээсинде жана CSFде (Figure S5A) кыйла кыскарган бир нече белоктор бар. Бул төмөндөтүлгөн мээ жүлүн суюктугу маркерлеринин арасында NPTX2 жана M1 VGF жана M12 хромогранин В бар. Бирок, бул өзгөчөлүктөргө карабастан, биздин синаптикалык маркерлердин көбү AD жүлүн суюктугунда көтөрүлөт. Жалпысынан алганда, бул анализдер биздин беш панелдин ар биринде мээнин жана жүлүн суюктугунун деңгээлиндеги статистикалык маанилүү тенденцияларды айырмалай алган. Бул тенденциялар ADдагы мээ менен CSF протеининин экспрессиясынын ортосундагы татаал жана көп учурда ар кандай мамилени баса белгилейт.
Андан кийин, биз биомаркерлердин 271 топтомун эң келечектүү жана кайталануучу максаттарга чейин кыскартуу үчүн жогорку өндүрүмдүүлүктөгү MS репликация анализин (CSF репликациясы 1) колдондук (Figure 5A). CSF көчүрмөсү 1 көзөмөл, AsymAD жана AD когорту (таблица S1A) камтыган Emory Goizueta ADRC жалпы 96 үлгүлөрүн камтыйт. Бул AD учурлары жумшак когнитивдик төмөндөө менен мүнөздөлөт (орточо MoCA, 20,0 ± 3,8), жана мээ жүлүн суюктугунда тастыкталган AD биомаркерлеринин өзгөрүүлөрү (таблица S1A). Биз тапкан CSF анализине карама-каршы, бул репликация натыйжалуураак жана жогорку өндүрүмдүүлүктөгү “бир жолу” MS ыкмасын (офлайндык фракцияларга бөлбөстөн), анын ичинде жеке үлгүлөрдүн иммунодепляциясынын зарылдыгын жок кылган үлгүлөрдү даярдоонун жөнөкөйлөтүлгөн протоколун колдонуу менен жүзөгө ашырылат. . Анын ордуна, азыраак протеиндердин (37) сигналын күчөтүү үчүн бир иммундук начар "жакшыртуу каналы" колдонулат. Бул жалпы протеомдун камтылышын азайтса да, бул бир атуу ыкмасы машинанын убактысын бир топ кыскартат жана жашоого жөндөмдүү талданууга мүмкүн болгон TMT-белгиленген үлгүлөрдүн санын көбөйтөт (17, 38). Бардыгы болуп, анализ 96 учурда 1183 протеомага карталанган 6 487 пептидди аныктады. Биз тапкан CSF анализиндей эле, үлгүлөрдүн кеминде 50% сандык көрсөткүчү болгон белоктор гана кийинки эсептөөлөргө киргизилип, маалыматтар жаш жана гендердик таасирлер үчүн регрессацияланган. Бул 792 протеоманын акыркы санын аныктоого алып келди, алардын 95% да табылган CSF маалымат топтомунда аныкталган.
(A) Биринчи репликацияланган CSF когортунда текшерилген мээге байланыштуу CSF белок максаттары жана акыркы панелге киргизилген (n = 60). (B E) төрт CSF репликация когорттарында ченелген Panel биомаркер деңгээли (композиттик z-упайлар). Жупташкан t-тесттер же ANOVA Тукейдин пост-түзөтүүсү менен ар бир кайталанма талдоодо молчулуктун өзгөрүшүнүн статистикалык маанисин баалоо үчүн колдонулган. КТ, контролдоо.
Биз комплекстүү талдоо аркылуу мээге байланышкан 271 CSF максаттарыбызды текшерүүгө өзгөчө кызыкдар болгондуктан, биз бул репликацияланган протеомду андан ары изилдөөнү ушул маркерлер менен чектейбиз. Бул 271 протеиндин ичинен 100ү CSF репликациясында аныкталган 1. Сүрөт S6A бул 100 дал келген маркерлердин башкаруу жана AD репликация үлгүлөрүнүн ортосундагы дифференциалдык туюнтмасын көрсөтөт. АДда синаптикалык жана метаболиттик гистондор эң көп көбөйөт, ал эми ооруда кан тамыр белоктору эң азаят. 100 кайталанган маркерлердин көпчүлүгү (n = 70) эки маалымат топтомундагы өзгөрүүнүн бирдей багытын сакташкан (Figure S6B). Бул 70 тастыкталган мээге байланыштуу CSF маркерлери (таблица S2H) негизинен мурда байкалган панелдин экспрессия тенденцияларын чагылдырат, башкача айтканда, кан тамыр белокторунун төмөндөшүн жана башка бардык панелдердин жогору жөнгө салынышын. Бул тастыкталган 70 протеиндин 10у гана AD молчулугундагы өзгөрүүлөрдү көрсөттү, бул панелдин тенденцияларына карама-каршы келет. Мээнин жана жүлүн суюктугунун жалпы тенденциясын эң жакшы чагылдырган панелди түзүү үчүн, биз бул 10 протеинди акыры текшерилген кызыкчылык панелинен чыгардык (Figure 5A). Ошондуктан, биздин панель акырында ар кандай үлгүлөрдү даярдоо жана MS платформа анализин колдонуу менен эки көз карандысыз CSF AD когортторунда текшерилген жалпы 60 протеинди камтыйт. CSF көчүрмөсү 1 башкаруу жана AD учурларда бул акыркы панелдердин z-упай туюнтма сюжеттери биз тапкан CSF когортунда байкалган панелдик трендди тастыктады (Figure 5B).
Бул 60 протеиндин арасында AD менен байланышы бар молекулалар бар, мисалы, көптөгөн изилдөөлөрдө AD менен байланышкан сезгенүүгө каршы цитокин болгон остепонтин (SPP1) жана GAP43, синаптикалык протеин. Бул ачык нейродегенерация менен байланышкан (42). Эң толук текшерилген белоктор башка нейродегенеративдик ооруларга байланыштуу маркерлер, мисалы, амиотрофиялык каптал склероз (ALS) менен байланышкан супероксид дисмутаза 1 (SOD1) жана Паркинсон оорусуна байланыштуу десахараза (PARK7) . Биз ошондой эле көптөгөн башка маркерлер, мисалы, SMOC1 жана мээге бай мембрана тиркеме сигнал берүүчү протеин 1 (BASP1) нейродегенерацияга мурунку байланыштары чектелүү экенин текшердик. Белгилеп кетсек, алардын CSF протеомундагы жалпы саны аз болгондуктан, MAPT жана башка AD менен байланышкан протеиндерди (мисалы, NEFL жана NRGN) ишенимдүү аныктоо үчүн бул жогорку өтүмдүү бир жолу аныктоо ыкмасын колдонуу биз үчүн кыйын экенин белгилей кетүү керек. ) ( 43, 44).
Андан кийин биз бул 60 приоритеттүү панель маркерлерин үч кошумча репликация анализинде текшердик. CSF Көчүрмө 2, биз Emory Goizueta ADRC (17) тартып 297 башкаруу жана AD үлгүлөрүнүн көз карандысыз когорт талдоо үчүн бир TMT-MS колдонгон. CSF репликациясы 3 Лозаннадан, Швейцариядан (45) келген 120 контролдон жана AD бейтаптарынан алынган TMT-MS маалыматтарынын кайра анализин камтыган. Ар бир маалымат топтомундагы 60 артыкчылыктуу маркердин үчтөн экисинен көбүн таптык. Швейцариялык изилдөө ар кандай MS платформаларын жана TMT сандык аныктоо ыкмаларын колдонсо да (45, 46), биз эки кайталанган анализде панелдин тенденцияларын катуу кайталадык (5-сүрөт, C жана D жана S2, I жана J таблицалары). Биздин топтун оорунун өзгөчөлүгүн баалоо үчүн, биз TMT-MSти төртүнчү репликация маалымат топтомун талдоо үчүн колдондук (CSF репликациясы 4), ага контролдук (n = 18) жана AD (n = 17) учурлары гана эмес, ошондой эле PD ( n = 14)), ALS (n = 18) жана frontotemporal деменция (FTD) үлгүлөрү (n = 11) (стол S1A). Биз бул когортадагы панелдик протеиндердин дээрлик үчтөн экисин (60тын 38ин) ийгиликтүү аныктадык. Бул жыйынтыктар бардык беш биомаркер панелдеринде AD-спецификалык өзгөрүүлөрдү баса белгилейт (Figure 5E жана Table S2K). метаболиттер тобунун өсүшү күчтүү AD өзгөчөлүгүн көрсөттү, андан кийин myelination жана глиалдык топ. Азыраак деңгээлде FTD бул панелдердин ортосундагы өсүштү көрсөтөт, бул тармактын окшош потенциалдуу өзгөрүүлөрүн чагылдырышы мүмкүн (17). Ал эми, ALS жана PD контролдоо тобунун дээрлик бирдей миелинация, глиалдык жана метаболом профилдерин көрсөттү. Жалпысынан алганда, үлгү даярдоо, MS платформа жана TMT сандык ыкмаларын айырмачылыктарга карабастан, бул кайталанган анализдер биздин артыкчылыктуу панел маркерлер 500 уникалдуу CSF үлгүлөрүндө AD өзгөчө өзгөрүүлөргө ээ экенин көрсөтүп турат.
AD нейродегенерациясы когнитивдик симптомдор башталганга чейин бир нече жыл мурун кеңири таанылган, ошондуктан AsymAD биомаркерлерине шашылыш муктаждык бар (5, 31). Бирок, барган сайын көбүрөөк далилдер AsymAD биологиясы бир тектүү эмес экенин көрсөтүп турат, ал эми тобокелдиктин жана туруктуулуктун татаал өз ара аракеттенүүсү оорунун кийинки өрчүшүндө чоң жеке айырмачылыктарга алып келет (47). AsymAD учурларын аныктоо үчүн колдонулса да, негизги CSF биомаркерлеринин деңгээли (Aβ1-42, жалпы tau жана p-tau) кимде деменцияга (4, 7) өнүгө турганын ишенимдүү алдын ала айта алган жок. Бул калктын тобокелдигин так стратификациялоо үчүн мээ физиологиясынын бир нече аспектилерине негизделген бүтүндөй биомаркер куралдарын киргизүү зарыл. Ошондуктан, биз кийинчерээк биздин AD тарабынан тастыкталган биомаркер панелибизди CSF 1-көчүрмөсүнүн AsymAD популяциясында талдадык. Бул 31 AsymAD учуру анормалдуу негизги биомаркердин деңгээлин (Aβ1–42 / жалпы tau ELISA катышы, <5.5) жана толук таанып билүүнү көрсөттү (орточо MoCA, 27.1). ± 2.2) (таблица S1A). Мындан тышкары, AsymAD менен ооруган бардык адамдарда 0 клиникалык деменция упайлары бар, бул күнүмдүк когнитивдик же функционалдык көрсөткүчтөрдүн төмөндөшүнө эч кандай далил жок экенин көрсөтүп турат.
Биз алгач бардык 96 CSF репликациясындагы 1, анын ичинде AsymAD когортундагы валидацияланган панелдердин деңгээлин анализдедик. Биз AsymAD тобунун бир нече панелдеринде AD сыяктуу молчулуктун олуттуу өзгөрүүлөрү бар экенин байкадык, тамыр панели AsymADда төмөндөө тенденциясын көрсөттү, ал эми башка бардык панелдер жогорулоо тенденциясын көрсөттү (Figure 6A). Ошондуктан, бардык панелдер ELISA Aβ1-42 жана жалпы tau деңгээли (Figure 6B) менен абдан маанилүү корреляцияны көрсөттү. Ал эми, топ менен MoCA упайынын ортосундагы корреляция салыштырмалуу начар. Бул анализдердин эң таң калыштуу ачылыштарынын бири - AsymAD когортундагы панелдердин көптүгү. 6А-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, AsymAD тобунун панелдин деңгээли адатта башкаруу тобунун жана AD тобунун панелинин деңгээлин кесип өтүп, салыштырмалуу жогорку өзгөрүлмөлүүлүгүн көрсөтөт. AsymADдын бул гетерогендүүлүгүн изилдөө үчүн биз 96 CSF репликациясынын 1 учуруна көп өлчөмдүү масштабдоо (MDS) анализин колдондук. MDS анализи маалыматтар топтомундагы айрым өзгөрмөлөрдүн негизинде учурлардын окшоштугун визуалдаштырууга мүмкүндүк берет. Бул кластердик анализ үчүн биз CSF ачылышында жана репликация 1 протеомунда (n = 29) (S2L таблицасы) деңгээлинде статистикалык маанилүү өзгөрүүгө ээ болгон валидацияланган панель маркерлерин гана колдонобуз. Бул талдоо биздин көзөмөлүбүз менен AD учурларынын ортосунда так мейкиндик кластерлерин түздү (Figure 6C). Тескерисинче, кээ бир AsymAD учурлары башкаруу тобунда так кластерленген, ал эми башкалары AD учурларда жайгашкан. Бул AsymAD гетерогендүүлүгүн мындан ары изилдөө үчүн биз MDS картасын колдонуп, бул AsymAD учурларынын эки тобун аныктадык. Биринчи топко контролго жакыныраак кластердик AsymAD учурлары камтылган (n = 19), ал эми экинчи топ ADга жакыныраак маркер профили бар AsymAD учурлары менен мүнөздөлгөн (n = 12).
(A) AsymAD, анын ичинде CSF репликация 1 когортундагы бардык 96 үлгүдөгү CSF биомаркер тобунун экспрессия деңгээли (z-упай). Тукейдин кийинки оңдоосу менен дисперсияны талдоо панелдин көптүгүнүн өзгөрүшүнүн статистикалык маанисин баалоо үчүн колдонулган. (B) ELISA Aβ1-42 жана CSF көчүрмөсү 1 үлгүлөрүндө MoCA эсеби жана жалпы tau деңгээли менен панелдик протеиндин көптүгү деңгээлин (z-упай) корреляциялык анализи. Тиешелүү P мааниси менен Пирсон корреляция коэффициенти көрсөтүлөт. (C) 96 CSF көчүрмөсү 1 учурлардын MDS ачылышында да, CSF көчүрмөсү 1 маалымат топтомдорунда да олуттуу өзгөргөн 29 тастыкталган панель маркерлеринин молдук деңгээлине негизделген [P <0.05 AD/control (CT)]. Бул талдоо AsymAD тобун башкаруу (n = 19) жана AD (n = 12) чакан топторуна бөлүү үчүн колдонулган. (D) Жанар тоонун сюжети эки AsymAD подгруппасынын ортосундагы -log10 статистикалык P маанисине салыштырмалуу log2 бүктөлгөн өзгөрүү (x огу) менен бардык CSF репликация 1 белокторунун дифференциалдык туюнтмасын көрсөтөт. Панелдин биомаркерлери түстүү. (E) CSF репликациясынын 1 молчулук деңгээли тандоо тобунун биомаркерлери AsymAD подгруппаларынын ортосунда дифференциалдуу түрдө көрсөтүлөт. Статистикалык мааниге баа берүү үчүн Тукейдин дисперсияны оңдоодон кийинки анализи колдонулган.
Биз бул башкаруунун жана AD сыяктуу AsymAD учурларынын ортосундагы дифференциалдык протеиндин экспрессиясын карадык (Figure 6D жана Table S2L). Натыйжада жанар тоо картасы 14 панель маркерлери эки топтун ортосунда олуттуу өзгөргөнүн көрсөтүп турат. Бул маркерлердин көбү синапстын жана метаболомдун мүчөлөрү. Бирок, тиешелүүлүгүнө жараша миелин жана глиалдык иммундук топтордун мүчөлөрү болуп саналган SOD1 жана myristoylated аланинге бай белоккиназа С субстраты (MARCKS) да ушул топко кирет (6-сүрөт, D жана E). Кан тамыр панели ошондой эле AD сыяктуу AsymAD тобунда олуттуу кыскарган эки маркерди кошкон, анын ичинде AE милдеттүү протеин 1 (AEBP1) жана толуктоочу үй-бүлө мүчөсү C9. ELISA AB1-42 (P = 0.38) жана p-tau (P = 0.28) менен контролдоо жана AD сыяктуу AsymAD чакан топторунун ортосунда эч кандай олуттуу айырма болгон эмес, бирок, чынында эле, жалпы tau деъгээлинде олуттуу айырма бар эле (P = 0.0031). ) (S7-сүрөт). Эки AsymAD подгруппасынын ортосундагы өзгөрүүлөр жалпы tau деңгээлдерине караганда олуттуураак экенин көрсөткөн бир нече панель маркерлери бар (мисалы, YWHAZ, SOD1 жана MDH1) (6E-сүрөт). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар биздин тастыкталган панелибиз симптомсуз оору менен ооруган бейтаптарды субтипке жана потенциалдуу тобокелдик стратификациясына ээ болгон биомаркерлерди камтышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
AD артындагы ар кандай патофизиологияны жакшыраак өлчөө жана бутага алуу үчүн системага негизделген биомаркер куралдарына чукул муктаждык бар. Бул инструменттер биздин AD диагностикалык негизин гана өзгөртпөстөн, ошондой эле натыйжалуу, бейтапка тиешелүү дарылоо стратегияларын кабыл алууга көмөктөшөт (1, 2). Бул максатта, биз мээге негизделген патофизиологиянын кеңири спектрин чагылдырган веб-негизделген CSF биомаркерлерин аныктоо үчүн AD мээге жана CSFге калыс комплекстүү протеомика ыкмасын колдондук. Биздин анализ беш CSF биомаркер панелдерин өндүрдү, алар (i) синапстарды, кан тамырларды, миелинди, иммундук жана метаболикалык дисфункцияны чагылдырат; (ii) ар кандай MS платформаларында күчтүү кайталануучулукту көрсөтүү; (iii) AD алгачкы жана кеч этаптарында прогрессивдүү ооруга мүнөздүү өзгөрүүлөрдү көрсөтүү. Жалпысынан алганда, бул табылгалар AD изилдөө жана клиникалык колдонмолор үчүн ар түрдүү, ишенимдүү, интернетке багытталган биомаркер инструменттерин өнүктүрүүгө карай келечектүү кадам болуп саналат.
Биздин натыйжалар AD мээ тармагы протеомунун жогорку деңгээлде сакталган уюмун көрсөтүп турат жана аны системага негизделген биомаркерди өнүктүрүү үчүн казык катары колдонууну колдойт. Биздин талдоо көрсөткөндөй, AD жана AsymAD мээлерин камтыган эки көз карандысыз TMT-MS маалымат топтому күчтүү модулдукка ээ. Бул табылгалар фронталдык, париеталдык жана убактылуу кортекстеги бир нече көз карандысыз когорттардан 2000ден ашык мээ ткандарынын күчтүү модулдарынын сакталышын көрсөтүп, мурунку ишибизди кеңейтет (17). Бул консенсус тармагы азыркы изилдөөдө байкалган ар кандай ооруларга байланыштуу өзгөрүүлөрдү чагылдырат, анын ичинде глиалга бай сезгенүү модулдарынын көбөйүшү жана нейронго бай модулдардын азайышы. Учурдагы изилдөөлөр сыяктуу эле, бул масштабдуу тармак да AsymADда ар кандай клиникага чейинки патофизиологияны көрсөтүүчү олуттуу модулдук өзгөрүүлөрдү камтыйт (17).
Бирок, бул өтө консервативдүү системага негизделген алкактын ичинде, өзгөчө AD алгачкы этаптарында адамдар арасында, көбүрөөк майда бүртүкчөлүү биологиялык гетерогендүүлүк бар. Биздин биомаркер панелибиз бир нече CSF маркерлеринин олуттуу дифференциалдык экспрессиясын көрсөткөн AsymADдагы эки подгруппаны чагылдыра алат. Биздин топ негизги AD биомаркерлер деъгээлинде ачык-айкын эмес, бул эки чакан топтордун ортосундагы биологиялык айырмачылыктарды баса алган. Контролдук топ менен салыштырганда, бул AsymAD адамдардын Aβ1-42 / жалпы tau катышы анормалдуу төмөн болгон. Бирок, Aβ1-42 жана p-tau деңгээли салыштырмалуу салыштырмалуу бойдон калган, ал эми эки AsymAD подгруппасынын ортосунда жалпы tau деңгээли гана олуттуу айырмаланган. Жогорку CSF tau Aβ1-42 деңгээлдерине (7) караганда когнитивдик симптомдордун жакшыраак болжолдоочусу болуп көрүнгөндүктөн, биз эки AsymAD когортасынын оорунун өрчүшүнүн ар кандай тобокелдиктери болушу мүмкүн деп шектенебиз. Биздин AsymAD үлгүсүнүн чектелген өлчөмүн жана узунунан берилген маалыматтардын жоктугун эске алуу менен, бул жыйынтыктарды ишенимдүү чыгаруу үчүн кошумча изилдөөлөр керек. Бирок, бул жыйынтыктар системага негизделген CSF панели оорунун симптомсуз стадиясында адамдарды натыйжалуу стратификациялоо жөндөмүбүздү күчөтө аларын көрсөтүп турат.
Жалпысынан алганда, биздин ачылыштар AD патогенезинде бир нече биологиялык функциялардын ролун колдойт. Бирок, жөнгө салынбаган энергия метаболизми биздин беш тастыкталган энбелгилөө панелдерибиздин негизги темасы болуп калды. Гипоксантин-гуанин фосфорибосилтрансфераза 1 (HPRT1) жана лактатдегидрогеназа А (LDHA) сыяктуу метаболикалык протеиндер AD CSFтин көбөйүшү жогорку репродукциялуу жыныстык экенин көрсөтүүчү эң бекем тастыкталган синаптикалык биомаркерлер болуп саналат. Биздин кан тамырларыбызда жана глиалдык панелдерибизде кычкылдануучу заттардын метаболизмине катышкан бир нече маркерлер бар. Бул табылгалар нейрондордун жогорку энергияга болгон муктаждыгын канааттандыруу үчүн гана эмес, ошондой эле астроциттердин жана башка глиалдык клеткалардын жогорку энергияга болгон муктаждыгын канааттандыруу үчүн бүт мээдеги зат алмашуу процесстеринин негизги ролуна шайкеш келет (17, 48). Биздин натыйжалар редокс потенциалынын өзгөрүшү жана энергия жолдорунун үзгүлтүккө учурашы AD патогенезине катышкан бир нече негизги процесстердин, анын ичинде митохондриялык бузулуулар, глиалдык сезгенүү жана кан тамырлардын жабыркашы (49) ортосундагы негизги байланыш болушу мүмкүн экендигинин өсүп жаткан далилдерин колдойт. Мындан тышкары, метаболикалык мээ жүлүн суюктугунун биомаркерлери биздин көзөмөлүбүз менен AD сыяктуу AsymAD подгруппаларынын ортосунда көп сандагы дифференциалдуу бай протеиндерди камтыйт, бул энергиянын жана редокстук жолдордун бузулушу оорунун клиникалык баскычында маанилүү болушу мүмкүн.
Биз байкаган ар кандай мээ жана жүлүн суюктугу панелинин тенденциялары да кызыктуу биологиялык кесепеттерге ээ. Нейрондорго бай синапстар жана метаболомдор AD мээсинин деңгээлинин төмөндөшүн жана жүлүн суюктугунун көбөйүшүн көрсөтөт. Нейрондор алардын көптөгөн адистештирилген сигналдарын энергия менен камсыз кылуу үчүн синапстарда энергия өндүрүүчү митохондрияларга бай экенин эске алсак (50), бул эки нейрондук топтун экспрессия профилдеринин окшоштугу күтүлөт. Нейрондордун жоголушу жана жабыркаган клеткалардын экструзиясы кийинки оорулардын бул мээ жана CSF панелинин тенденцияларын түшүндүрө алат, бирок алар биз байкаган алгачкы панелдик өзгөрүүлөрдү түшүндүрө албайт (13). Алгачкы асимптоматикалык оорунун бул табылгалары үчүн мүмкүн болгон түшүндүрмөлөрдүн бири анормалдуу синаптикалык кесүү болуп саналат. Чычкан моделдериндеги жаңы далилдер микроглия менен шартталган синаптикалык фагоцитоз ADда анормалдуу түрдө активдешип, мээдеги синапстын эрте жоголушуна алып келиши мүмкүн экенин көрсөтүп турат (51). Бул ташталган синаптикалык материал CSFде топтолушу мүмкүн, ошондуктан биз нейрон панелинде CSF көбөйүшүн байкайбыз. Иммундук ортомчу синаптикалык кыркуу да жарым-жартылай биз оорунун жүрүшүндө мээде жана жүлүн суюктугунда байкалган глиалдык протеиндердин көбөйүшүн түшүндүрүшү мүмкүн. Синаптикалык кыркуудан тышкары, экзоциттик жолдогу жалпы аномалиялар да нейрондук маркерлердин ар кандай мээ жана CSF туюнтмаларына алып келиши мүмкүн. Бир катар изилдөөлөр АД мээнин патогенезинде экзосомалардын мазмуну өзгөргөнүн көрсөттү (52). Клеткадан тышкаркы жол да Aβ пролиферациясына катышат (53, 54). Белгилей кетчү нерсе, экзосомалык секрецияны басуу AD трансгендик чычкан моделдеринде AD сыяктуу патологияны азайтышы мүмкүн (55).
Ошол эле учурда, кан тамыр панелиндеги белок AD мээнин орточо өсүшүн көрсөттү, бирок олуттуу CSF төмөндөгөн. Кан-мээ тосмосунун (BBB) дисфункциясы бул жыйынтыктарды жарым-жартылай түшүндүрө алат. Көптөгөн көз карандысыз өлүмдөн кийин адам изилдөөлөр AD (56, 57) BBB бузулушун көрсөттү. Бул изилдөөлөр эндотелий клеткаларынын бул бекем жабылган катмарынын айланасындагы ар кандай анормалдуу иш-аракеттерди, анын ичинде мээ капиллярларынын агып кетишин жана кан аркылуу өткөн протеиндердин периваскулярдык топтолушун тастыктады (57). Бул мээдеги кан тамыр белокторунун жогорулашына жөнөкөй түшүндүрмө бере алат, бирок мээ жүлүн суюктугундагы ошол эле белоктордун түгөнүшүн толук түшүндүрө албайт. Мүмкүнчүлүктөрдүн бири - борбордук толкунданып системасы бул молекулаларды активдүү түрдө обочолонуп, сезгенүүнүн жана кычкылдануу стрессинин көбөйүшүнүн көйгөйүн чечүү. Бул панелдеги кээ бир эң оор CSF белокторунун кыскарышы, айрыкча липопротеинди жөнгө салууга катышкандар, сезгенүүнүн зыяндуу деңгээлдерин жана реактивдүү кычкылтек түрлөрүнүн нейропротектордук процессин бөгөт коюу менен байланышкан. Бул пароксоназа 1 (PON1), кан айлануудагы кычкылдануу стрессинин деңгээлин төмөндөтүү үчүн жооптуу болгон липопротеинди байланыштыруучу энзимге тиешелүү (58, 59). Alpha-1-микроглобулин / бикунин прекурсор (AMBP) тамыр тобунун дагы бир кыйла төмөндөтүлгөн маркер болуп саналат. Бул липиддерди ташуучу бикуниндин прекурсору, ал ошондой эле сезгенүүнү басууга жана неврологиялык коргоого катышат (60, 61).
Ар кандай кызыктуу гипотезаларга карабастан, биохимиялык оорунун механизмдерин түздөн-түз аныктоо мүмкүн эместиги ачылышка негизделген протеомика анализинин белгилүү чектөөсү болуп саналат. Ошондуктан, бул биомаркердик панелдердин артында механизмдерди ишенимдүү аныктоо үчүн мындан аркы изилдөөлөр зарыл. MS негизинде клиникалык талдоо өнүктүрүүгө карай жылыш үчүн, келечектеги багыты, ошондой эле тандоо же параллелдүү реакция мониторинг (62) сыяктуу ири масштабдуу биомаркер текшерүү үчүн максаттуу сандык ыкмаларын колдонууну талап кылат. Биз жакында эле параллелдүү реакция мониторинг (63) бул жерде сүрөттөлгөн CSF белок өзгөрүүлөрдүн көбү ырастоо үчүн колдонулат. Бир нече приоритеттүү панелдин максаттары олуттуу тактык менен аныкталат, анын ичинде YWHAZ, ALDOA жана SMOC1, алар тиешелүүлүгүнө жараша синапсыбызга, метаболизмибизге жана сезгенүү панелдерибизге (63). Көз карандысыз маалыматтарды алуу (DIA) жана башка MS негизиндеги стратегиялар да максаттуу текшерүү үчүн пайдалуу болушу мүмкүн. Буд жана башкалар. (64) Жакында биздин CSF ачылыш маалыматтар топтомубузда аныкталган AD биомаркерлери менен үч түрдүү европалык когорттун 200гө жакын CSF үлгүлөрүнөн турган көз карандысыз DIA-MS маалымат топтомунун ортосунда олуттуу дал келүү бар экени көрсөтүлдү. Бул акыркы изилдөөлөр биздин панелдерибиздин MS негизиндеги ишенимдүү аныктоого айлануу мүмкүнчүлүгүн колдойт. Салттуу антитело жана аптамердин негизинде аныктоо AD негизги биомаркерлерин андан ары өнүктүрүү үчүн да маанилүү. CSF аз молдугуна байланыштуу, бул биомаркерлерди MS ыкмаларын колдонуу менен аныктоо кыйыныраак. NEFL жана NRGN - бул биздин комплекстүү анализибизде панелге түшүрүлгөн, бирок биздин бирдиктүү MS стратегиябызды колдонуу менен ишенимдүү түрдө аныктоого мүмкүн болбогон CSF биомаркерлеринин эки мисалы. PEA сыяктуу бир нече антителолорго негизделген максаттуу стратегиялар бул маркерлердин клиникалык өзгөрүшүнө өбөлгө түзүшү мүмкүн.
Жалпысынан алганда, бул изилдөө ар кандай системалардын негизинде CSF AD биомаркерлерди аныктоо жана текшерүү үчүн уникалдуу протеомика мамилени камсыз кылат. Бул маркер панелдерин кошумча AD когортторунда жана MS платформаларында оптималдаштыруу AD тобокелдигин стратификациялоону жана дарылоону алдыга жылдыруу үчүн келечектүү болушу мүмкүн. Убакыттын өтүшү менен бул панелдердин узунунан кеткен деңгээлин баалоочу изилдөөлөр маркерлердин кайсы айкалышы оорунун эрте пайда болуу коркунучун жана оорунун катуулугунун өзгөрүшүн эң жакшы стратификациялай турганын аныктоо үчүн абдан маанилүү.
CSF тарабынан көчүрүлгөн 3 үлгүлөрдү кошпогондо, бул изилдөөдө колдонулган бардык CSF үлгүлөрү Emory ADRC же жакын изилдөө мекемелеринин колдоосу астында чогултулган. Бул протеомика изилдөөлөрүндө Emory CSF үлгүлөрүнүн жалпысынан төрт топтому колдонулган. CSF когортунда 20 дени сак контролдоочу жана 20 AD пациенттеринин үлгүлөрү бар экени аныкталган. CSF 1-көчүрмөсү 32 дени сак контролдоочулардан, 31 AsymAD инсанынан жана 33 AD инсанынан үлгүлөрдү камтыйт. CSF 2 көчүрмөсү 147 башкарууну жана 150 AD үлгүсүн камтыйт. Көп оорулуу CSF репликациясынын 4 когортуна 18 башкаруу, 17 AD, 19 ALS, 13 PD жана 11 FTD үлгүлөрү кирген. Эмори университетинин институттук кароо кеңеши тарабынан бекитилген келишимге ылайык, Эмори изилдөөсүнүн бардык катышуучулары маалымдалган макулдуктарды алышты. 2014-жылы Альцгеймер борборлору үчүн Карылык мыкты тажрыйбанын Улуттук институтуна ылайык (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), жүлүн суюктугу белдин пункциясы менен чогултулуп, сакталган. Control жана AsymAD жана AD бейтаптары Emory Cognitive Neurology Clinic же Goizueta ADRC боюнча стандартташтырылган таанып билүү баа алышты. Алардын жүлүн суюктугунун үлгүлөрү ELISA Aβ1-42, жалпы tau жана p-tau талдоо (65) үчүн INNO-BIA AlzBio3 Luminex тарабынан сыналган. ELISA баалуулуктары белгиленген AD биомаркеринин кесүү критерийлеринин негизинде субъекттердин диагностикалык классификациясын колдоо үчүн колдонулат (66, 67). Башка CSF диагноздору үчүн негизги демографиялык жана диагностикалык маалыматтар (FTD, ALS жана PD) ошондой эле Emory ADRC же туунду изилдөө институттарынан алынат. Бул Эмори CSF учурлары үчүн кыскача иш метаберилиштерин S1A таблицасынан тапса болот. Swiss CSF репликациясынын 3 когортунун мүнөздөмөлөрү мурда жарыяланган (45).
CSF үлгүсүн тапты. CSF маалыматтар топтомун ачуунун тереңдигин жогорулатуу максатында, трипсинациядан мурун жогорку протеиндерди иммундук керектөө жүргүзүлгөн. Кыскача айтканда, 40 жеке CSF үлгүлөрүнүн 130 мкл CSF жана бирдей көлөмдөгү (130 мкл) High Select Top14 Bol Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) айланма колонкага (Thermo Fisher Scientific, A89868 бөлмөсүндө) жайгаштырылды. температура Инкубация). 15 мүнөт айланткандан кийин үлгүнү 1000 г 2 мүнөткө центрифугалаңыз. 3K ультрацентрифугалуу чыпкалоочу аппарат (Millipore, UFC500396) 30 мүнөт бою 14,000 г центрифугалоо жолу менен агынды суунун үлгүсүн концентрациялоо үчүн колдонулган. Бардык үлгү көлөмүн фосфат буфердүү туз менен 75 мкл чейин суюлтуңуз. Белоктун концентрациясы өндүрүүчүнүн протоколуна (Thermo Fisher Scientific) ылайык bicinchoninic acid (BCA) ыкмасы менен бааланган. Бардык 40 үлгүдөгү иммундук жетишсиз CSF (60 мкл) лизил эндопептидаза (LysC) жана трипсин менен сиңирилди. Кыскача айтканда, үлгү кыскартылган жана 1,2 мкл 0,5 M tris-2 (-carboxyethyl) -phosphine жана 3 мкл 0,8 M chloroacetamide 90 ° C 10 мүнөт менен alkylated, андан кийин 15 мүнөт бою суу мончодо sonicated. Үлгү 193 мкл 8 М карбамид буфери [8 М карбамид жана 100 мМ NaHPO4 (рН 8,5)] менен 6 М карбамиддин акыркы концентрациясына чейин суюлтулган. LysC (4,5 мкг; Wako) бөлмө температурасында түн ичинде сиңирүү үчүн колдонулат. Андан кийин үлгү 50 мМ аммоний бикарбонаты (ABC) менен 1 М карбамидге чейин суюлтулган (68). Бирдей өлчөмдө (4,5 мкг) трипсинди (Промега) кошуп, андан кийин үлгүнү 12 саатка инкубациялаңыз. Чачылган пептиддик эритмени 1% кумурска кислотасынын (FA) жана 0,1% трифтор уксус кислотасынын (TFA) (66) акыркы концентрациясына чейин кычкылдандырып, андан кийин жогоруда айтылгандай 50 мг Sep-Pak C18 колонкасы (Суулар) менен тузсуздандырыңыз (25) . Андан кийин пептид 1 мл 50% ацетонитрилде (ACN) элюцияланган. Партиялар боюнча протеиндин санын аныктоону стандартташтыруу үчүн (25), CSFтин бардык 40 үлгүсүнөн 100 мкл аликвоттар аралаш үлгүнү түзүү үчүн бириктирилди, ал андан кийин беш глобалдык ички стандарт (ГИС) (48) үлгүгө бөлүндү. Бардык жеке үлгүлөр жана курама стандарттар жогорку ылдамдыктагы вакуумда (Labconco) кургатылат.
CSF үлгүнү көчүрөт. Дайон жана кесиптештери мурда CSF көчүрмөсү 3 үлгүлөрүнүн иммундук начарлоосу жана сиңирүү сүрөттөлгөн (45, 46). Калган репликация үлгүлөрү жекече иммунодеплитацияланган эмес. Жогоруда айтылгандай, бул алынбаган үлгүлөрдү трипсинге сиңирип алыңыз (17). Ар бир кайталанган талдоо үчүн, ар бир үлгүдөгү элюталанган пептиддин 120 мкл аликвоту бириктирилген жана TMT менен белгиленген глобалдык ички стандарт катары колдонула турган бирдей көлөмдөгү аликвотторго бөлүнгөн (48). Бардык жеке үлгүлөр жана курама стандарттар жогорку ылдамдыктагы вакуумда (Labconco) кургатылат. Ар бир үлгүдөн 125 мкл айкалыштыруу менен аз мол болгон CSF протеининин сигналын күчөтүү үчүн ар бир репликация анализи үчүн “жакшыртылган” үлгү даярдалды [б.а. изилдөө үлгүсүн туураган биологиялык үлгү, бирок жеткиликтүү көлөм алда канча чоңураак (37, 69)] аралаш CSF үлгүсүнө кошулган (17). Андан кийин аралаш үлгү 12 мл High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) менен иммуноремаланып, жогоруда сүрөттөлгөндөй сиңирилип, кийинки бир нече TMT этикеткасына киргизилди.
Посттун убактысы: 27-август-2021